华银健康助力华南农业大学兽医学院科研团队在动物细菌耐药性研究中做出重大突破
6月24日，华银健康合作客户，来自华南农业大学兽医学院的刘雅红教授团队，在微生物学领域顶级期刊Nature Microbiology（IF=14.3）上在线发表了题为“Plasmid-encoded tet(X) genes that confer high-level tigecycline resistance in Escherichia coli”的最新学术成果。
其中，华银健康提供了对E. coli LHM10-1菌株的全基因组学服务，为该研究的机制探索提供了可靠的数据基础。
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研究概要
该文章揭示并发现从动物及养殖环境中，可以导致最后一道防线药物替加环素(Tigecycline)失活的降解酶Tet(X4)。一旦细菌获得该酶的基因，就能获得降解所有的四环素类抗生素包括FDA(美国食品药品监督管理局)新批准的伊拉瓦环素(Eravacycline)的耐药能力。
该酶的发现，可能导致世界各国对四环素类抗生素使用政策做出调整，也必将影响四环素类抗生素的研发方向。这是刘雅红教授团队继在黏菌素耐药基因传播机制（Nature Microbiology，2016；Trends in Microbiology，2018）之后的又一重要研究成果。
替加环素(Tigecycline)是美国辉瑞公司（原惠氏公司）在米诺环素基础上开发的第三代四环素类药物，2011年在我国获批上市，能够有效克服传统的外排泵和核糖体保护耐药机制而不易产生耐药，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌感染均有良好的治疗效果。近年来，随着碳青霉烯类药物和黏菌素耐药性的爆发，使得替加环素(Tigecycline)逐步成为人类面临多重耐药细菌感染的“最后一道防线”，目前仅被批准应用于人医临床复杂性腹腔内感染、复杂皮肤及软组织感染和社区获得性肺炎的治疗。
然而，随着替加环素(Tigecycline)的不断使用，人医临床甚至是畜禽养殖业有关替加环素(Tigecycline)耐药性的报道时有发生。本研究最初于2017年分离到一株耐替加环素(Tigecycline)的猪源大肠杆菌，接合转移和全基因组测序表明其携带一个潜在的可移动四环素降解酶，被命名为Tet(X4)。克隆表达和流行病学调查结果表明，Tet(X4)能够介导对包含替加环素(Tigecycline)和依拉瓦环素（eravacycline）在内的所有四环素类药物的高水平耐药,并且在广东、广西、福建、江西和江苏均有检出。
进一步研究发现，该tet(X4)基因位于泛宿主范围的IncQ1型质粒，它能够携带tet(X4)基因高效地转移到实验室保存菌株甚至产碳青霉烯酶的各种临床耐药菌株。尤其重要的是，临床菌中的质粒可以协助携带tet(X4)的IncQ1质粒再次快速转移，这进一步增加了该耐药基因的传播风险并给临床治疗带来巨大的挑战。
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研究材料
在这项研究中，作者对一个由质粒介导的可移动的耐替加环素(Tigecycline)的基因tet(X4)的传播机制进行研究，并探讨tet(X4)阳性的大肠杆菌菌株在人类活动场所、肉禽产地以及周围环境中的传播情况。样本类型包括3-8月龄的肉猪和7-20周龄的家鸡的粪便样本，也包括当地的土壤，尘土，污水以及蔬菜样本。同时，也涵盖来自医院的临床样本。合计共有4189份样本用于研究。
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研究结果
1.Tet（X4）在体外以及体内环境中对四环素类抗生素的作用
通过同源建模对Tet（X4）的结果进行确定，发现其为1,158个碱基的长度，位于IncQ1质粒pLHM101-p6上。Tet(X4)基因能够编码385个氨基酸蛋白 。
琼脂小室扩散实验结果表明，添加了JM109 + pBAD24-tet(X4)的大肠杆菌上清液，能够消除四环素抑制区，而在阴性对照和空白对照之间无明显变化。该结果提示我们四环素(X4)已失活 （图2b） 。进一步地，(LC-MS/MS)结果表明，四环素的水平能够在与大肠杆菌JM109 + pBAD24-tet(X4)共培养16 h后得到维持，而依拉瓦环素（eravacycline）水平却低得多。
综上可知，Tet（X4）能够对整个四环素家族的成员产生抗性。
2、对携带IncQ1 tet(X4)的质粒pLHM10-1-p6进行特性研究
在大肠杆菌LHM10-1中，携带tet(X4)的质粒pLHM10-1-p6为12783 bp的长度，平均GC含量为55.4%，其中包含15个预测的开放阅读框(ORFs)，而tet(X4)位于两个移动原件ISCR2拷贝附近（图3a）。
基于质粒复制子的分析结果，发现质粒pLHM10-1-p6属于IncQ1类型，即拥有用于质粒复制与转移的IncQ1质粒骨干基因。通过数据库比对的结果表明质粒pLHM10-1-p6与IncQ1类型的质粒存在相似的可复制以及移动的区域（图3b）。以上结果提示我们，质粒pLHM10-1-p6的起源，可能是由tet(X4)进入IncQ1质粒所引起的，而且潜在地与ISCR2的易位有关。
此外，偶联试验表明，替加环素(Tigecycline)耐药性能成功地从质粒pLHM10转移到实验室培养的质粒C600中（图3c）。经过22天（大约220代）没有抗生素治疗的连续传代后，发现pLHM10-1-p6仍稳定维持，包括在亲本大肠杆菌LHM10-1和转偶联剂宿主，以及临床来源的CRE菌株（图3d）。
3、使用PFGE-XbaI实验进行多位点序列分型
使用基于XbaI位点酶切的PFGE（脉冲场凝胶电泳）对所有tet（X4）阳性的大肠杆菌菌株进行分型，结果显示，显示42种 tet(X4)阳性的大肠杆菌可以归类为9种不同的序列类型。总的来说，多位点序列分型的结果与脉冲场凝胶电泳的脉冲型的分析结果一致（图4）。
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总结展望
本研究强调，我们社会需要一个“One-Health”战略(即考虑到人类，动物和他们的环境这样的大跨度)来应对抗菌剂的耐药性问题，如不同部门的联合协作对传染性病监测和控制是最为重要的。为了保证我们今后有药物可用，应考虑对人类和禽类环境中的tet(X4)的传播建立实地监测方案，而同时政府则需要明智地对动物体内和环境中的四环素进行监控。
